免疫比濁法測(cè)定糖化血紅蛋白含量

成人的血紅蛋白（Hb）通常由HbA（97%）、HbA2（2.5%）和HbF（0.5%）組成。HbA又可分為非糖化血紅蛋白，即天然血紅蛋白HbA0（約90%）和糖化血紅蛋白HbA1（約5-7%）。根據(jù)糖化位點(diǎn)和反應(yīng)參與物的不同，HbA1可以進(jìn)一步分為HbA1a、HbA1b、HbA1c等亞基組分。其中HbA1c占HbA1的80%，化學(xué)結(jié)構(gòu)為具有特定六肽結(jié)構(gòu)的血紅蛋白分子。其形成過(guò)程是血紅蛋白β鏈N端纈氨酸與葡萄糖的醛基首先發(fā)生快速反應(yīng)形成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物醛亞胺（西佛氏堿），繼而經(jīng)過(guò)Amadori轉(zhuǎn)位，分子重排緩慢形成穩(wěn)定不可逆的酮胺化合物，即HbA1c。HbA1c濃度相對(duì)恒定，故臨床常用HbA1c代表總的糖化血紅蛋白水平，能直接反應(yīng)機(jī)體血糖水平，是臨床監(jiān)控糖尿病患者血糖控制水平的較好的檢測(cè)指標(biāo)。

糖化血紅蛋白測(cè)定方法多達(dá)60多種，主要分為兩類：1. 基于電荷差異的檢測(cè)方法，包括離子交換層析、高校液相色譜分析和電泳法等；2. 基于結(jié)構(gòu)差異的檢測(cè)方法，包括親和層析和免疫法等。目前臨床上應(yīng)用比較多的是免疫比濁方法及HPLC法，本文主要就免疫比濁法測(cè)定糖化血紅蛋白含量做一介紹。

原理

利用TTAB（Tetradecyl trimethyl ammonium bromide，四癸基三甲胺溴化物）作為溶血?jiǎng)脕?lái)消除白細(xì)胞物質(zhì)的干擾（TTAB不溶解白細(xì)胞）。血液樣本不需要去除不穩(wěn)定HbA1的預(yù)處理,用濁度抑制免疫學(xué)方法測(cè)定。
先加入抗體緩沖液,樣本中的糖化血紅蛋白（HbA1c）和其抗體反應(yīng)形成可溶性的抗原-抗體復(fù)合物,因?yàn)樵贖bA1c分子上只有一個(gè)特異性的HbA1c抗體結(jié)合位點(diǎn),不能形成凝集反應(yīng)。然后,加入多聚半抗原緩沖液,多聚半抗原和反應(yīng)液中過(guò)剩的抗HbA抗體結(jié)合,生成不溶性的抗體-多聚半抗原復(fù)合物,再用比濁法測(cè)定。
同時(shí)在另一通道測(cè)定Hb濃度,溶血液中的血紅蛋白轉(zhuǎn)變成具有特征性吸收光譜的血紅蛋白衍生物,用重鉻酸鹽作標(biāo)準(zhǔn)參照物,進(jìn)行比色測(cè)定Hb濃度。
根據(jù)Hb含量和HbA1c含量,計(jì)算出HbA1c的百分比。

試劑

1. HbA1c測(cè)定試劑

(1)R1試劑:0.025mol/L MES（2- morpholinoethanesulfonic acid,2-嗎啉乙基磺酸）緩沖液；0.015mo/L Tris緩沖液（pH6.2）；HbA1c抗體和穩(wěn)定劑；
(2) R2試劑:0.025mol/L MES緩沖液；0.015mo/ L Tris緩沖液（pH6.2）；HbA1c多聚半抗原（≥8μg/ml）和穩(wěn)定劑.
(3)標(biāo)準(zhǔn)液:人血和綿羊血制備的溶血液,9g/L TTAB和穩(wěn)定劑。

2. Hb測(cè)定試劑 0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）和穩(wěn)定劑。

3. 溶血試劑 9g/L TTAB溶液。

4. 質(zhì)控物正常值或異常值兩種。

5. 9%NaCl。

操作

于小試管中,加溶血試劑1ml,加入人EDTA或肝素抗凝血10μ,輕輕旋渦混勻,避免形成氣泡,待溶血液的顏色由紅色變?yōu)樽鼐G色后（大約1~2分鐘）即可使用。此溶血液于15~25℃可穩(wěn)定24小時(shí),2~8℃可穩(wěn)定24小時(shí)
根據(jù)不同型號(hào)生化分析儀及配套試劑設(shè)定參數(shù),測(cè)定HbA1c濃度和測(cè)定Hb濃度。詳細(xì)操作程序,必須根據(jù)儀器和配套試劑盒的說(shuō)明書。