RT-qPCR檢測(cè)原理

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT）與實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）相結(jié)合，是當(dāng)下病原學(xué)分子診斷的常用方法。RT-qPCR以RNA為起始材料，在RT階段，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板形成互補(bǔ)的DNA鏈（cDNA）。隨后以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。RT-qPCR已被用于多種分子生物學(xué)的應(yīng)用中，其中包括病原體檢測(cè)、基因測(cè)試、疾病研究和基因表達(dá)分析。

1.RT-qPCR的一步法與兩步法

1）一步法：將逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起，使逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng)。由于兩步反應(yīng)都在一個(gè)管中完成，因此該方法具有更少的實(shí)驗(yàn)誤差和移液步驟，減少污染的風(fēng)險(xiǎn)。

2）兩步法：將逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過(guò)程分開(kāi)，在兩個(gè)管中完成檢測(cè)。需要使用不同的緩沖液、反應(yīng)條件、以及引物設(shè)計(jì)策略。由于反應(yīng)分步進(jìn)行，能夠優(yōu)化單一反應(yīng)過(guò)程的反應(yīng)緩沖液和反應(yīng)條件，可建立長(zhǎng)期保存，并用于多次反應(yīng)的穩(wěn)定cDNA庫(kù)。

2.RT階段

RNA是逆轉(zhuǎn)錄的模板。根據(jù)來(lái)源材料的類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，有多種方法可進(jìn)行RNA的提取。較常用的有Trizol法、離心柱法和磁珠法。在RT階段，引物在退火時(shí)與單鏈RNA結(jié)合，提供給逆轉(zhuǎn)錄酶一個(gè)用于合成的起點(diǎn)位置。逆轉(zhuǎn)錄酶利用RNA合成cDNA，得到穩(wěn)定的RNA-DNA雜交鏈。

引物可分為三種引物Oligo引物（dT）、隨機(jī)引物和序列特異性引物。Oligo引物（dT）包含錨定位點(diǎn)，確保引物結(jié)合至mRNA 3'端poly(A）尾部。隨機(jī)引物長(zhǎng)度6-9個(gè)堿基，在RNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，可退火至多個(gè)位點(diǎn)，提高cDNA產(chǎn)量。序列特異性引物是靶向特異的RNA序列的定制引物，可產(chǎn)出特異的cDNA庫(kù)。通常情況下將Oligo引物與隨機(jī)引物混合使用為逆轉(zhuǎn)錄酶提供結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)檢測(cè)RNA病毒時(shí)需要使用序列特異性引物，結(jié)合在靶標(biāo)序列上。

逆轉(zhuǎn)錄酶需要具有較高熱穩(wěn)定性和較低核糖核酸酶H（RNase H）活性。較高熱穩(wěn)定性可以保證逆轉(zhuǎn)錄酶在整個(gè)反應(yīng)中的活性來(lái)獲得更高的 cDNA 產(chǎn)量，減少非特異性擴(kuò)增。較低的RNase H活性可以減少RNA的降解來(lái)避免截短cDNA。

3.qPCR階段

1）染料法：加入一對(duì)引物和SYBR GreenⅠ熒光染料。退火階段，引物特異性結(jié)合在兩條鏈上，為DNA聚合酶提供結(jié)合位點(diǎn)。SYBR GreenⅠ熒光染料是一種DNA雙鏈小溝結(jié)合染料，DNA聚合酶延伸引物，形成雙鏈，染料結(jié)合于雙鏈小溝中發(fā)出熒光。反應(yīng)體系內(nèi)雙鏈DNA濃度越高熒光信號(hào)越強(qiáng)。由于染料法無(wú)法在同一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)多個(gè)目的片段，還會(huì)受到引物二聚體的影響。在這種情況下，需要進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析，判斷擴(kuò)增所得產(chǎn)物是否只有一種。

圖1. 染料法發(fā)光原理

2）探針?lè)ǎ簩晒馊玖咸鎿Q為一條Taq Man探針。探針具有與靶標(biāo)互補(bǔ)的序列，5'端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)探針完整時(shí)，熒光信號(hào)會(huì)被淬滅基團(tuán)吸收。退火階段，探針特異性結(jié)合到靶標(biāo)序列上，DNA聚合酶沿5'-3'方向合成新鏈直至探針 5'端時(shí)，聚合酶水解探針，使熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，產(chǎn)生熒光。3'端淬滅基團(tuán)阻止探針被DNA聚合酶擴(kuò)增。Taq Man探針結(jié)合的目標(biāo)越多，熒光信號(hào)越強(qiáng)。理論上，探針?lè)ㄖ械臒晒庵粊?lái)源于靶標(biāo)，也就是不受非特異性擴(kuò)增和引物二聚體影響。

圖2. 探針?lè)òl(fā)光原理

4.結(jié)果分析

1）熔解曲線(xiàn)：當(dāng)擴(kuò)增完成后，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行升溫檢測(cè)，同時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。當(dāng)?shù)竭_(dá)某一溫度后，雙鏈DNA迅速解鏈，熒光信號(hào)驟降。當(dāng)信號(hào)達(dá)到最低時(shí)，即可獲得熒光信號(hào)強(qiáng)度隨溫度變化的原始圖譜。對(duì)原始圖譜進(jìn)行負(fù)導(dǎo)數(shù)轉(zhuǎn)換，繪制熒光信號(hào)變化與溫度的關(guān)系圖，圖中峰值對(duì)應(yīng)的溫度即為T(mén)m值。基于Tm值的差異，便可區(qū)分產(chǎn)物。

熔解曲線(xiàn)一般用于染料法，出現(xiàn)單峰說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好；出現(xiàn)雜峰特異性差，存在非特異性擴(kuò)增。若熔解曲線(xiàn)只有單峰且對(duì)應(yīng)溫度是退火溫度則是靶標(biāo)發(fā)出的熒光，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

圖3. 染料法熔解曲線(xiàn)

2）擴(kuò)增曲線(xiàn)：將已知濃度的靶標(biāo)稀釋幾個(gè)數(shù)量級(jí)后進(jìn)行qPCR反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增，并用產(chǎn)生的熒光信號(hào)與相應(yīng)濃度生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將未知樣本的Ct值與該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，可以確定其濃度。

熒光閾值是PCR 3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍（熒光閾值要設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期）。qPCR的擴(kuò)增曲線(xiàn)與熒光閾值交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)就是循環(huán)數(shù)（Ct）值。Ct值越低證明樣本中靶標(biāo)越多。從qPCR的曲線(xiàn)中可以看出，在基線(xiàn)期，沒(méi)有明顯的熒光信號(hào)。隨著循環(huán)數(shù)的增加，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)。在平臺(tái)期，因酶活降低或dNTP被消耗殆盡，曲線(xiàn)趨于平緩。

圖4. qPCR擴(kuò)增曲線(xiàn)

參考文獻(xiàn)

[1]Green M R, Joseph S. Quantification of RNA by Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)[J]. Cold Spring Harbor protocols, 2019.
[2]Hawkins S, Guest P C. Multiplex Analyses Using Real-Time Quantitative PCR[J]. Springer New York, 2017.
[3]Nayar G, Seabolt E, Kunitomi M, et al. Analysis and Forecasting of Global RT-PCR Primers for SARS-CoV-2[J]. Scientific Reports, 2021, 11(1).
[4]Kulesh D A, Loveless B M, Norwood D, et al. Monkeypox virus detection in rodents using real-time 3'-minor groove binder TaqMan assays on the Roche LightCycler.[J]. Laboratory Investigation, 2004, 84(9): 1200-1208.

相關(guān)產(chǎn)品

• SRT逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）
• Boost^TM熱啟動(dòng)taq酶
• 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（SYRB Green mix）

相關(guān)閱讀

• 新型冠狀病毒檢測(cè)方法介紹