新型冠狀病毒（2019-nCoV）檢測方法介紹-核酸檢測

冠狀病毒是一類具有包膜、基因組為線性單股正鏈的RNA病毒。人體感染冠狀病毒后通常引起感冒、發(fā)燒等癥狀，嚴(yán)重者能造成死亡。2020年1月于武漢發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒（2019-nCoV）是目前發(fā)現(xiàn)的第七種能夠感染人類的冠狀病毒。判定人體是否感染冠狀病毒通常有三種途徑，分別是對冠狀病毒的編碼基因（RNA）進(jìn)行檢測、對冠狀病毒基因表達(dá)的特定蛋白（如Spike蛋白）進(jìn)行檢測以及對冠狀病毒侵入人體后產(chǎn)生的IgG/IgM進(jìn)行檢測。本文主要對2019-nCoV核酸檢測的原理及方法做一介紹。

檢測原理

冠狀病毒的編碼基因是RNA，通過測定樣本中是否含有新型冠狀病毒基因，即可判斷患者是否被感染。RNA檢測主要依賴于逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光PCR（RT-PCR）技術(shù)。

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光PCR技術(shù)

PCR的全稱為聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)，是一種用于放大擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)微量DNA片段的大幅擴(kuò)增。其基本原理是先將雙鏈DNA解鏈為單鏈，隨后以單鏈DNA為模板，借助人工合成的一段核酸片段（引物）來??? 啟動合成，最終合成新的雙鏈DNA。在PCR反應(yīng)體系中，DNA雙螺旋被解鏈成單鏈后，引物與單鏈DNA的特定序列結(jié)合，形成一小段的雙鏈DNA，隨后在合適的溫度下進(jìn)行延伸，形成新的雙鏈DNA。每經(jīng)過一個循環(huán)，核酸數(shù)量就會增加1倍，經(jīng)過28-35個循環(huán)，即可將微量的核酸片段變的肉眼可見。

PCR擴(kuò)增流程

由于2019-nCoV的編碼基因?yàn)镽NA，因此需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該技術(shù)稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。在逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系中加入熒光探針，隨著PCR的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，通過熒光信號，實(shí)現(xiàn)對逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物（DNA序列）的實(shí)時監(jiān)測。

2019-nCoV序列的引物設(shè)計

核酸檢測的準(zhǔn)確性由引物的特異性決定，引物特異性不高會導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，最終影響測定結(jié)果。目前核酸檢測所使用的引物序列，基本都是針對病毒序列中高度保守的2至3個序列（比如編碼replicase復(fù)制酶或者necleocapsid核蛋白衣的核酸序列）來進(jìn)行設(shè)計。2019-nCoV的引物序列如下圖所示：

核酸檢測引物

檢測步驟

核酸檢測現(xiàn)主要通過檢測試劑盒實(shí)現(xiàn)，檢測步驟主要分為樣本采集、RNA提取及PCR擴(kuò)增三部分。

樣本采集

常規(guī)的樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等，依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行樣本的采集。獲得樣本后需盡快進(jìn)行檢測。

RNA提取

利用核酸提取試劑盒對RNA進(jìn)行提取，空氣中含有大量的RNA酶，RNA在空氣中極易降解，因此需做好保護(hù)措施（如加入能抑制核酸酶活性的物質(zhì)）。在提取得到RNA后需立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增

最后將RNA放入PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，并觀察擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增后的核酸序列帶有熒光，如果檢測到熒光信號曲線符合病毒特征，那么就認(rèn)為該疑似患者為陽性。在實(shí)際操作過程中，需對一位患者進(jìn)行多次檢測

提取病毒RNA本身也包含裂解樣本，提純RNA等多個工序，需要花費(fèi)數(shù)小時。而RT-PCR一般來說也需要至少三四個小時才能完成。因此整個流程預(yù)計需要一個工作日，即6-8小時左右，檢測結(jié)果都需要經(jīng)過復(fù)核，重復(fù)實(shí)驗(yàn)則需要花費(fèi)雙倍的時間。

檢測特點(diǎn)

核酸檢測是分子層面上的檢測，就現(xiàn)有所有的快速檢測方法來看，這種方法檢測的特異性和靈敏度都是最高的。由于這一檢測方法靠的是分子層面的特異性結(jié)合，因此只要公布的基因序列沒有問題，相關(guān)技術(shù)的檢測準(zhǔn)確率可以達(dá)到99.9%。

核酸檢測與蛋白檢測方式對比

	核酸檢測	蛋白檢測
準(zhǔn)確性	依賴于引物的特異性	依賴于抗體的親和力
待測物	RNA	蛋白
操作	需要提取RNA，流程繁瑣	血清檢測，流程簡單
周期	長，需要6-8h	短，只需15-30min
試劑盒開發(fā)難度	難度小，開發(fā)周期短	需獲得特異性抗體，難度大，開發(fā)周期長
試劑盒生產(chǎn)成本	低	高
試劑盒用途	新冠肺炎篩查確診	與核酸檢測聯(lián)合使用，降低假陰性

參考文獻(xiàn)

[1]. Lu H, Stratton CW, Tang YW. Outbreak of pneumonia of unknown etiology in Wuhan China: the mystery and the miracle. J Med Virol 2020; published online Jan 16. DOI:10.1002/jmv.25678.
[2]. 耿合員, 譚文杰. 新近發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒研究進(jìn)展[J]. 病毒學(xué)報, 2013(1):65-70.
[2]. 趙煥英, 包金風(fēng). 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志, 2007, 16(4):492-497.